Опубликовано 01.06.2016

          Анисимов В.Н., Забежинский М.А.,  Попович И Т., Плисc Г.Б. и др.
         НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Минздравсоцразвития РФ

         "Вопросы онкологии", 2012, том 58, № 1(выдержки из статьи)

Увеличение продолжительности активной жизни человека является одной из важнейших задач геронтологии и в целом современной профилактической медицины. В связи с этим встает вопрос о безопасности длительного применения средств продления жизни, что включает не только непосредственные побочные и токсические эффекты, но и отдаленные последствия, включая развитие новообразований [Анисимов В.Н., 1976; Anisimov V.N., 2001; Anisimov V.N., 2006; Anisimov V.N., 2009; Hefti F.F., Bales R., 2006; Rattan S.LS., 2005; Warner H. R., Ingram D. et al., 2000]. С другой стороны, прогресс медицины невозможен без создания новых фармакологических препаратов, среди которых средства с противоопухолевой и антиканцерогенной активностью представляют особый интерес. В настоящей статье обобщен опыт доклинических испытаний новых фармакологических препаратов, включающих выявление их противоопухолевой, антиканцерогенной и геропротекторной активности, накопленный в отделе канцерогенеза и онкогеронтологии НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова [Анисимов В.Н., Забежинский М.А. и др., 2011].

Выбор биологических объектов для исследований

Весьма удобными и часто используемыми объектами при изучении биологической активности новых препаратов являются крысы и мыши [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005; Ingram D.K., Jucker M., 1999; Miller R.A., Harrison D.E. et al., 2007]. Их легко содержать и разводить, продолжительность их жизни сравнительно невелика (2-3 года для мышей и 3-4 года для крыс). Физиология грызунов имеет значительное сходство с физиологией человека, особенно на клеточном уровне, что позволяет широко использовать их для тестирования фармакологических средств и экстраполяции результатов таких исследований на человека [Anisimov V.N., Ukraintseva S.V., 2005].

Существует большое число разнообразных инбредных линий мышей и крыс с хорошо охарактеризованным фенотипом и патологией (см., например, Jackson Laboratories Strain Information, http://axmice.jax.org.jaxmicedb/html.inbred/shtmi). Выбор той или иной линии может определяться конкретными задачами исследования или такими их особенностями, которые дают дополнительную важную информацию, поставленную при планировании эксперимента. В последнее время при биологическом тестировании часто используют инбредные линии генетически модифицированных животных.

Характерным свойством инбредных линий является их генетическая однородность, т.е. все особи в исследуемой и контрольной популяции идентичны генетически, что позволяет уменьшить число животных в группах.

Часто испытания проводят на аутбредных (беспородных) мышах, которые генетически гетерогенны и в некоторой степени более соответствуют гетерогенности человеческой популяции. Однако при использовании таких мышей нужно их большое количество в группах, так как в противном случае, некоторые аллели могут быть утеряны и генетическая характеристика со временем может измениться. Следует также отметить, что популяции аутбредных животных поддерживаются стадной разводкой, т.е. они генетически достаточно однородны.

Спектр ассоциированной с возрастом патологии, прежде всего новообразований, у крыс существенно шире, чем у мышей [Анисимов В.Н., 1976; Анисимов, 2008; Anisimov V.N., 1987; Smith G.S., Walford R.L. et al., 1973, Ward J.M.,1983]. У большинства линий крыс преобладают доброкачественные опухоли эндокринных желез, молочной железы (у самок), лимфомы и лейкозы. Однако хорошо известны линии крыс с исключительно высокой частотой опухолей одной локализации.

Полагаем, что многолетний опыт использования той или иной линии мышей и крыс в лаборатории, проводящей биологические испытания, должен стать определяющим при выборе объектов для тестирования различных препаратов. При возможности мы используем в своих исследованиях все три типа животных – инбредных, аутбредных и генетически модифицированных.

В ряде работ обсуждается роль таких важных для корректного проведения экспериментов факторов, как условия содержания и диета [Anisimov V.N., 1987; Nadon N.L., 2006; Ward J.M., 1983]. Следует заметить, что содержание животных в условиях стерильного вивария (SPF, specific pathogenic free) не оказывает существенного влияния на продолжительность их жизни [Snyder D.L., Pollard M. et al., 1990].

В целом, многие параметры, такие как условия содержания, диета, состояние здоровья, генетическая характеристика лабораторных животных, пол, размер выборки (число животных в контрольной и подопытных группах), могут контролироваться и изменяться в зависимости от задач исследования [Анисимов, 2008; Анисимов В.Н., Забежинский М.А. и др., 2011; Anisimov V.N., 2001; Anisimov V.N., Popovich I.G. et al., 2007; Miller R.A., Nadon N.L., 2000; Nadon N.L., 2006]. Полагают, что при выборе модели необходимо исходить из принципов экономической реалистичности выполнения проекта, технической выполнимости и воспроизводимости его результатов.

Химиопрофилактику рака в настоящее время определяют как использование фармакологических или натуральных агентов с целью предотвращения возникновения инвазивного рака путем блокирования повреждений ДНК, инициирующих канцерогенез, или путем задержки и обратного развития пренеопластических клеток с поврежденной ДНК [Meyskens F.L., Curt G.A. et al., 2011]. Антиканцерогенные вещества подразделяют на два класса: 1) ингибиторы инициации – предупреждающие абсорбцию и формирование канцерогенов, блокирующие агенты; 2) ингибиторы промоции, или подавляющие агенты [Naithani R., Huma L.C. et al., 2008].

Потенциальные химиопрофилактические средства выявляются в эпидемиологических исследованиях, в лабораторных экспериментах и клинических испытаниях. Для испытания антиканцерогенной активности препаратов предложены различные системы in vivo и in vitro [Попович И.Г., Забежинский М.А., 2003].

Системы in vitro основаны на регистрации торможения тестируемыми препаратами трансформации клеточных и органных культур. Трансформация культур вызывается чаще всего воздействиями химических канцерогенов (полициклических ароматических углеводородов, нитрозосоединений и др.), используемых в качестве инициаторов, в сочетании с опухолевыми промоторами [12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетатом (ТФА), фенобарбиталом и др.]. Используются также клеточные культуры, трансформированные онкогенами. Использование подобных культур в качестве тест-систем для выявления антиканцерогенных препаратов обладает рядом преимуществ: относительной дешевизной, сравнительно быстрой регистрацией результатов, возможностью использования культур клеток человека). Основным недостатком этих систем является невозможность регистрировать возникновение и развитие опухолей и, соответственно, ингибирующий эффект тестируемых соединений. Поэтому системы in vitro целесообразно использовать для скрининга (предварительного отбора) препаратов с потенциальными антиканцерогенными свойствами.

Основным методом для выявления средств химиопрофилактики рака является использование систем in vivo. В настоящее время экспериментальная онкология располагает возможностями моделировать практически в любом органе опухоли, близкие по гистологическому типу к новообразованиям у человека. Для тестирования и оценки эффективности антиканцерогенных веществ чаще всего используются модели опухолей, индуцированные в различных органах-мишенях у лабораторных грызунов с помощью химических канцерогенов.

Наряду с химическими канцерогенами, для индукции опухолей используются и различные виды излучений (гамма-радиация, рентгеновские лучи, радионуклиды, например 90Sr и 137Cs, ультрафиолетовое облучение). Преимуществом моделей индуцированных опухолей является стандартизация процесса канцерогенеза, возможность изучения влияния препарата на различные его стадии (инициацию, промоцию, прогрессию), а также относительно небольшая продолжительность опытов (обычно в пределах 6-12 мес).

Другую группу моделей составляют спонтанные опухоли. Тестирование потенциальных антиканцерогенных веществ на моделях спонтанных опухолей требует значительного времени (исследование проводится, как правило, в течение всей жизни животного), однако позволяет оценить последствия длительного применения подобных препаратов, что важно для экстраполяции полученных экспериментальных данных на человека. 

Критериями наличия антиканцерогенных свойств у тестируемых препаратов являются: уменьшение частоты индуцируемых и спонтанных опухолей, их множественности, размеров, увеличение латентного периода их развития. На ранних сроках таких исследований может регистрироваться также развитие предопухолевых изменений, определяемых по биомаркерам опухолевого риска, включающих генетические нарушения, хромосомные аберрации, уровень клеточной пролиферации, образование аберрантных фокусов и нарушение дифференцировки тканей. Учитывается также системное действие исследуемого препарата на метаболизм, нейроэндокринную и иммунную системы. 

Средства для химиопрофилактики рака в идеале должны отвечать следующим основным требованиям: 1) доказанная на экспериментальных моделях и в клинических испытаниях эффективность – способность предупреждать возникновение и развитие злокачественной опухоли определенной локализации или ряда локализаций; 2) возможность применения в течение длительного времени – многолетнего или даже постоянного в течение всей жизни; 3) отсутствие токсических эффектов или минимальная токсичность, чтобы риск возможных осложнений был допустимым в сравнении со снижением риска возникновения рака; 4) желательные дополнительные благоприятные свойства, достигаемые в более короткие сроки; 5) лекарственные формы должны быть только пероральными, в некоторых случаях — местными для нанесения на кожу и слизистые оболочки [8]. В научной и практической медицине растет интерес к природным антиканцерогенным веществам, содержащимся в пищевых продуктах, лекарственных растениях, которые отвечают большинству требований к «идеальным» средствам для профилактики рака [Harrison D.E., Strong R. et al., 2009].