---

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

1.2. ГИГИЕНА. ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Исследование канцерогенных свойств химических веществ и биологических продуктов в хронических опытах на животных

Методические рекомендации
МР 1.2.0068-12

Издание официальное
Москва -2012

 

---

         Исследование канцерогенных свойств химических веществ и
         биологических продуктов в хронических опытах на животных:
         Методические рекомендации.-М.: Федеральный центр гигие­ны
         и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2012.— 11 с.

        13ВК' 978-5-7508-1155-7

1. Разработаны Учреждением Российской Академии медицинских наук «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина» РАМН (д.м.н. проф. Л.Н.Пылев., д.м.н. проф. А. П.Ильницкии, О.В.Смирнова, ); ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.И.Петрова» Минздрава России (д.м.н. проф. В.Н.Анисимов, д.м.н. проф. Г.Б.Плисс, д.м.н. проф. М.А.Забежинский); ФГУ «Российский кардиологический научно-пропзводственный комплекс» Минздрава России (д.м.н. проф. Е.В.Арзамас­цев): Уральской Государственной Медицинской Академией (д.м.н. проф. Г.Я.Липатов).

2.  Одобрены Комиссией по канцерогенным факторам при Федераль­ной службе по надзор}' в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека.

3.  Утверждены  Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным госу­дарственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онишенко 30 августа 2012 г.

4.  Введены взамен «Методических рекомендаций по исследованию канцерогенных свойств химических веществ и биологических продуктов в хронических опытах на животных», 1981 г.

 

Содержание

1.  Общие положения

2.  Принципы и критерии отбора веществ и биологических продуктов для
     изучения канцерогенных свойств

3.  План эксперимента

4.  Определение максимально переносимой дозы

5.  Пути введения

6.  Лабораторные животные

7.  Продолжительность опыта

8.  Вскрытие животных, гистологическая обработка и морфологическое
     исследование

9.  Документация и обработка результатов

Библиографический список

 

---

УТВЕРЖДАЮ

                                                                                                    Руководитель Федеральной службы по надзору в
                                                                                                    сфере защиты прав потребителей и благополучия
                                                                                                    человека, Главный государственный санитарный
                                                                                                    врач Российской Федерации
                                                                                                    Г. Г. Онишенко

                                                                                                    30 августа 2012 г.
                                                                                                    Дата введения: с момента утверждения

1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ. САНИТАРИЯ

Исследование канцерогенных свойств химических веществ и биологических продуктов в хронических опытах на животных

Методические рекомендации МР 1.2.0068—12

---

1. Общие положения

Развитие промышленности и сельского хозяйства предполагает по­явление в сфере обращения веществ с неизученной биологической ак­тивностью, в том числе канцерогенностью. Контакт человека с такими веществами может иметь неблагоприятные отдаленные последствия, в частности, возникновение злокачественных опухолей различной локали­зации.

Своевременное выявление канцерогенных свойств вещества является основой для принятия мер по предотвращению его действия на человека и проведению соответствующих профилактических мероприятий. Основ­ными из них являются: замена вещества на неканцерогенное, герметиза­ция и автоматизация производства, оценка и управление рисками.

Хронические эксперименты на животных во всем мире продолжа­ют оставаться единственным методом, позволяющим, несмотря на ряд ограничений, ответить на вопрос о канцерогенных свойствах вещества.

В соответствии с Положением о Комитете по канцерогенным веще­ствам, правоприемником которого является Комиссия по канцерогенным факторам при Роспотребнадзоре. Результаты испытаний веществ на канцерогенность следует направлять в указанную Комиссию на экспертизу.

 

Организации (лаборатории), проводящие исследования на канцерогенность в тестах на лабораторных животных, должны иметь помещения для содержания и работы с лабораторными животными (виварии, кли­ники лабораторных животных), требования к которым изложены в сани­тарных правилах по устройству, оборудованию и содержанию вивариев.

2. Принципы и критерии отбора веществ и биологических продуктов для изучения канцерогенных свойств

2.1.  В связи с длительностью и высокой стоимостью хронических экспериментов на животных по тестированию канцерогенных свойств соединения перед началом испытаний проводится работа по отбору со­единений наиболее подозрительных в наличии этого вида биологичес­кой активности и требующих испытания в первую очередь.

2.2.  В этой работе следует руководствоваться следующими прин­ципами и критериями:

2.2.1.  Наличие   данных  о   возникновении   опухолей  среди   лиц, имевших   контакт  с   веществом   (эпидемиологических,   диспансерных и др.). Описание отдельных  клинических случаев заболевания также может служить основанием для отбора.  При использовании данного критерия необходимо учитывать длительность латентного периода воз­никновения опухолей у людей и, естественно, отсутствие упомянутых данных для новых или недавно внедренных в обращение соединений.

2.2.2. Отбираются вещества и биологические продукты, имеющие (уже или в перспективе) широкое распространение среди населения и наличие вероятности появления в объектах окружающей человека сре­ды, а также в пищевых продуктах. При этом оценивается вероятность попадания или наличие вещества в среде обитания человека, а не его концентрация.

2.2.3.  Наличие химического структурного сходства с известными канцерогенными веществами или их метаболитами.

2.2.4. Обладающие цитостатическими, ростстимулирующими, иммунодепрессивными. гормоноподобными и алкилирующими свойства­ми. Данные показатели являются только критериями при отборе, их от­сутствие или наличие не характеризуют канцерогенные потенции со­единения.

2.2.5.  Положительные результаты в тестах на мутагенность (in vivo и in vitro) и в тестах ДНК-повреждений.

Часто встречающаяся корреляция между мутагенными и канцеро­генными свойствами вещества придает при отборе данному критерию особую значимость. В то же время по мутагенности судить о канцеро­генных свойствах соединения не следует, к тому же имеются так называемые «негенотоксичные канцерогены». При наличии у соединения мутагенных свойств даже в нескольких тестах можно предположить о его канцерогенности. Однако этого недостаточно для утверждения на­личия этих свойств и принятия каких-либо законодательных и социаль­ных мероприятий по критерию канцерогенности. Отсутствие мутаген­ных свойств не позволяет предполагать отсутствие канцерогенности. Аналогичная ситуация имеет место и в тестах ДНК-повреждений.

2.2.6. Вещества, получаемые биотехнологическими, генноинженерными и нанотехнологическими методами.

Упомянутые принципы и критерии отбора имеют различную зна­чимость, все они служат как для выявления веществ, нуждающихся в изучении в первую очередь, так и для обоснования необходимости ис­следования соединения.

Чаще всего часть упомянутых критериев отсутствует, поскольку речь идет, как правило, о новых соединениях. В таком случае решающим является пункт 2.2.2 настоящих методических рекомендации, а также опыт исследователя или обращение за экспертной оценкой в Ко­миссию по канцерогенным факторам при Роспотребнадзоре.

3. План эксперимента

3.1.  Соединения сложного состава или промышленные продукты, имеющие различного рода примеси, изучаются целиком (для пестици­дов - возможно действующее вещество). Необходимость исследования канцерогенных свойств составляющих обсуждается после завершения эксперимента с основным соединением в случае выявления его канцеро­генных свойств.

3.2.  При тестировании на канцерогенность следует стремиться  к созданию условий, обеспечивающих максимальное проявление у веще­ства этих свойств, исходя из концепции, что таковое возможно при ис­пользовании максимально переносимой дозы (далее - МПД). В соответ­ствии с международным определением  МПД является максимальной дозой, не приводящей в субхроническом эксперименте к гибели живот­ного или торможению массы тела более чем на 10 %.

3.3.  Следует использовать минимум два вида (крысы, мыши) экспе­риментальных животных (не менее 50 голов каждого пола в подопыт­ных и контрольных группах). Для оценки доза-эффектной зависимости, которая является важным дополнительным критерием наличия канцеро­генной активности, необходимо использовать не менее трех (3) доз ве­щества, не считая контрольной группы, где доза принимается за нуле­вую (0). За максимальную следует брать МПД, каждая последующая доза должна отличаться от предыдущей не менее чем в 1.5—2,0 раза.

4. Определение максимально переносимой дозы

Определение МПД включает два этапа и проводится на каждом ви­де животных обоего пола при каждом предполагаемом методе введения вещества при тестировании.

4.1.  Острая токсичность. Понятие острой токсичности включает вредное действие соединения,  проявляющееся  при однократном  или кратковременном его применении. Задачей эксперимента является опре­деление   LD₁₀, LD₁₆, LD₅₀, LD₈₄ вещества,   используя  метод  пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону.

4.2.  Определение МПД в субхроническом опыте. Эксперимент про­водят на 10 животных 6-8-недельного возраста обоего пола (при каж­дом методе введения, дозе и каждом виде). Максимальная доза находит­ся на уровне LD₁₆, следующая - LD₁₀, а каждые последующие четыре (4) дозы в 1,5-2 раза ниже предыдущей. Соединения вводят животным в течение 6-8 недель (в режиме хронического эксперимента) и затем 2 недели наблюдают за их состоянием. Критерием токсического эффекта является гибель животных или торможение нарастания массы тела. За МПД принимается максимальная доза вещества, не приводящая к гибе­ли животного и вызывающая торможение прироста массы тела менее чем на 10%. При тестировании на канцерогенность МПД соединения может изменяться, но не в сторону увеличения.

5. Пути введения

5.1.  Наиболее распространенным и адекватным естественному яв­ляется введение испытуемого соединения животным перорально (зон­дом, с пищей или питьевой водой). Вещество вводят ежедневно, через зонд - 5 раз в неделю. Дозу рассчитывают в мг/кг и ррт массы тела или потребляемой пищи.

5.2.  При наличии каких-либо особенностей в контакте человека с испытуемым соединением или в локализации индуцируемых им у чело­века опухолей путь введения может быть другим (подкожный, накож­ный, внутрилегочный, внутриплевральный, внутрибрюшинный, транс­плацентарный и др.). Режим введения вещества при этом подбирается индивидуально для каждого метода.

5.3.  Необходимо соблюдение условий, приближенных к правилам надлежащей лабораторной практики в соответствии с приказом Мини­стерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики».

Принципы надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice (GLP)): система обеспечения качества, имеющая отношение к процессам организации, планирования, порядку проведения и контролю испытаний в области охраны здоровья человека и безопасности окру­жающей среды, а также оформления, архивирования и представления результатов этих испытаний.

6. Лабораторные животные

6.1.  Для хранения, размещения, обработки и защиты тест-систем животных должны быть созданы надлежащие условия, обеспечивающие достоверность получаемых результатов.

6.2.  Вновь полученные тест-системы животных должны быть изо­лированы для оценки состояния их здоровья. При возникновении забо­левания или смертности данную партию животных не используют в ис­следовании и, при необходимости, безболезненно подвергают эвтаназии. На момент начала исследования все тест-системы должны быть полно­стью здоровы. Тест-системы, у которых в ходе исследования выявлены заболевания или травмы, следует изолировать и лечить, если это необ­ходимо для обеспечения  полноты исследования. Диагнозы  и лечение любых заболеваний, как в ходе исследования, так и до его начала долж­ны быть документированы.

6.3.  Должна быть  предусмотрена регистрация данных об  источ­никах тест-систем, датах их поступления и состоянии на момент посту­пления.

6.4.  Перед первоначальным введением испытуемого или стандарт­ного объекта исследования биологические тест-системы должны пройти период акклиматизации, достаточный для адаптации к условиям иссле­дования.

6.5.  Вся  информация, необходимая для надлежащей идентифика­ции тест-системы, должна быть указана на дверях помещений или кон­тейнерах. Отдельные тест-системы, которые должны быть переведены из их помещений или контейнеров в процессе исследования, должны иметь соответствующую маркировку.

6.6.  Помещения и контейнеры для содержания тест-систем подле­жат регулярной уборке и санитарной обработке. Материалы, контакти­рующие с тест-системой, не должны содержать загрязняющие вещества в количествах, способных повлиять на ход исследования. Подстилку для животных следует своевременно менять. Все случаи использования пес­тицидов должны быть документированы.

6.7.  Для тестирования веществ на канцерогенность наиболее часто используют крыс и мышей. Обязательным является линейность живот­ных и их чувствительность к канцерогенным соединениям. Можно ре­комендовать крыс Вистар и мышей гибридов F₁(СВАхС₅₇Вl₆).

6.8.  Тестирование следует начинать на молодых (8—12-недельных) животных. Следует при их содержании соблюдать условия, приближен­ные к правилам надлежащей лабораторной практики.

6.9.  Стандартизация корма животных является обязательным усло­вием экспериментов по тестированию веществ на канцерогенность.

6.10.  Взвешивание животных должно проводиться в начале опыта. еженедельно - в течение первых двух месяцев, два раза в месяц - в те­чение последующих двух, а затем - ежемесячно.

6.11.  В связи с вариабельностью в частоте спонтанных опухолей, каждый эксперимент должен иметь адекватные по возрасту и количест­ву контрольные группы животных.

7. Продолжительность опыта

7.1.  Тестируемое вещество вводится крысам в течение 24 месяцев, мышам - 18 месяцев. По истечении стандартного срока оставшиеся в живых животные могут быть подвергнуты эвтаназии сразу, через 3 ме­сяца или оставлены на дожитие (по решению экспериментатора). Если к этому сроку выжило более 50 % животных введение вещества целесооб­разно продолжить до их гибели.

7.2.  Используемые схемы и дозы введения канцерогенных веществ должны быть модифицированы в соответствии с видовыми особенно­стями используемых лабораторных животных.

8. Вскрытие животных, гистологическая обработка и морфологическое исследование

Павшие или подвергнутые эвтаназии животные опытных и кон­трольных групп подвергаются тщательному патолого-анатомическому исследованию. Все внутренние органы фиксируют в 10%-м растворе нейтрального формалина, который заменяют через 7 дней. Фиксация продолжается в течение минимум 1,5 месяцев, после чего производится вырезка кусочков для гистологической обработки (промывка, проводка через спирты, заливка в парафин, резка на микротоме и окраска срезов). Окраску препаратов проводят общепринятыми методами (прежде всего гематоксилинэозином). Морфологическое исследование должно прово­диться специалистом, обладающим знаниями в области патологии и он­кологии экспериментальных животных.

9. Документация и обработка результатов

9.1. Ход экспериментов подробно протоколируется в журнале, на каждое животное заводится протокол вскрытия с указанием пола, сро­ков эксперимента, степени посмертных изменений, данных вскрытия,  взятых на гистологическую обработку органов, гистологического номе­ра с шифром (серия, год и др.), а также результатов морфологического изучения препаратов. В журнале приводится подробное описание изу­чаемого вещества, методики эксперимента, регистрируется изменение в ходе опыта массы тела каждого животного, обосновывается корректи­ровка доз и режима введения вещества.

9.2.  Корректировка доз и режима введения вещества проводится в зависимости от частоты гибели животных и торможения массы их тела. Увеличивать МПД нельзя. Осмотр животных проводят ежедневно.

9.3.  По результатам исследования составляются таблицы с указани­ем метода введения вещества, пола животного, общего и эффективного числа животных, количества и процента опухолей (общего и у каждого пола, по отдельным их локализациям). Указываются сроки обнаружения первой опухоли и средний латентный период.

9.4.   За эффективное  число животных (из  которого исчисляется процент опухолей) принимается количество переживших время возник­новения (выявления) первой опухоли. Оно исчисляется отдельно для каждого пола и всех животных в группе, и может быть общим для всего эксперимента (отдельно для каждого вида) при отсутствии между груп­пами выраженных различий в смертности. При наличии последних воз­можно в качестве эффективного числа использовать исходное количест­во животных или эффективное для каждой группы. Для выявления раз­личий в выживаемости (смертности) животных составляются таблицы по опытным и контрольным группам.

9.5.  Статистическая обработка результатов проводится различными общепринятыми   методами:  по   Стьюденту-Фишеру,   по χ², дозовому тренду и методу Пето для случайных и фатальных опухолей.

9.6.  Вещество признается обладающим канцерогенными свойства­ми, если даже в одной из подопытных групп имеется статистически зна­чимое  превышение частоты  опухолей  (в  том  числе спонтанных)  по сравнению с их количеством в контрольной (в том же самом экспери­менте). Возможно в качестве дополнения использование «историческо­го» контроля.

9.7.  Руководство лаборатории ответственно за вид представления от­четов о результатах исследований. Вид представления отчета (электрон­ный или на бумажном носителе) и способ передачи из лаборатории долж­ны быть согласованы с пользователями лабораторных услуг. Результаты исследования должны быть представлены четко, без ошибок в написании. Отчет о результатах исследования представляется в Комиссию по канце­рогенным факторам при Роспотребнадзоре. Экспертное заключение Ко­миссии вместе с отчетом исполнитель направляет заказчику.

 

Библиографический список

1.  Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпиде­миологическом благополучии населения».

2.  Федеральный закон от 10.01.2002 № 7-ФЗ «Об охране окружаю­щей среды».

3.  Федеральный закон от 26.06.2008 № 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений».

4.  Постановление  Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31.10.2007 № 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов».

5.  ГОСТ Р 53434—2009 «Национальный стандарт Российской Фе­дерации. Принципы надлежащей лабораторной практики».

6.  СанПиН 1.2.2353—08 «Канцерогенные факторы и основные тре­бования к профилактике канцерогенной опасности».

7.  Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики».

8.  Приказ   Министерства   здравоохранения   СССР  от   12.08.1977 № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных».

9.  ГОСТ 7.32—2001   «Отчёт о научно-исследовательской  работе. Структура и правила оформления